Linker U: Uno de los 2 posibles Linkers nitzipper® que puedes añadir a cualquiera de las piezas que vendemos en nuestra tienda, y que se une selectivamente a cualquier otra pieza que incorpore el Linker T. 

Linker T: Uno de los 2 posibles Linkers nitzipper® que puedes añadir a cualquiera de las piezas que vendemos en nuestra tienda, y que se une selectivamente a cualquier otra pieza que incorpore el Linker U.

nitzipper®: Tu Tecnología de Marcaje de Anticuerpos para realizar Inmunoensayos

Inmunohistoquímica

Inmunohistoquímica

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En esta página, encontrarás los siguientes apartados:



¿Qué es Inmunohistoquímica?

La inmunohistoquímica (IHC) se refiere al proceso en el que se usan anticuerpos para detectar antígenos en un corte o sección de tejido biológico. Utilizando la unión específica de los anticuerpos con los antígenos, es posible localizar y visualizar dichos antígenos diana en cortes histológicos gracias a los anticuerpos específicos marcados con fluoróforos o enzimas, siendo estas últimas las más utilizadas en IHC.

La inmunohistoquímica, también llamado marcaje inmunohistoquímico, se utiliza comúnmente en diferentes tipos de aplicaciones tales como:

  • Diagnóstico de células anormales presentes por ejemplo, en diferentes estadios de enfermedades (cáncer, entre otras), el desarrollo de fármacos y la investigación biológica. Los biomarcadores específicos son característicos de cada evento celular, tal como la proliferación o la apoptosis, que son las causas de la anormalidad celular.
  • El desarrollo de fármacos para evaluar la eficacia del fármaco, la detección de la variación de la actividad de las dianas de cada enfermedad.
  • La investigación biológica para conocer la ubicación y la colocalización de una proteína dentro de las diferentes partes de una célula (núcleo, citoplasma o membrana, etc.)

Mientras que el uso de anticuerpos adecuados para dirigirse específicamente a los antígenos correctos y amplificar la señal, es importante para la visualización de los antígenos, una preparación completa y correcta de la muestra es un paso importante para mantener la morfología celular, la arquitectura del tejido y la antigenicidad de los epítopos diana. Esto requiere una recolección adecuada de tejido, perfusión, fijación del tejido, inclusión y corte, etc.

 

Anticuerpos Monoclonales y Policlonales

Los anticuerpos son producidos y purificados en dos formas básicas para su uso como reactivos en inmunoensayos: monoclonales y policlonales.

  • Los anticuerpos monoclonales son mono-específicos para un único epítopo antigénico y por consiguiente se considera que son más específicos para el antígeno diana que los anticuerpos policlonales. Además, los anticuerpos monoclonales generalmente tienen una mayor afinidad que los anticuerpos policlonales y, por consiguiente son generalmente una mejor opción para técnicas de inmunohistoquímica. Los anticuerpos monoclonales son especialmente útiles como anticuerpos primarios en aplicaciones que requieren una sola especificidad de epítopo y un suministro que no cambia durante muchos años de uso.

  • Los anticuerpos policlonales son una mezcla compleja y heterogénea de anticuerpos, generalmente purificada directamente a partir de un suero, que reconocen varios epítopos antigénicos y que tienen menos probabilidad de ser afectados por los cambios conformacionales que los anticuerpos monoclonales, lo que demuestra que tienen una menor afinidad. Los anticuerpos policlonales son especialmente útiles como anticuerpos secundarios marcados en inmunoensayos.


¿Cómo visualizar el complejo anticuerpo/antígeno?         

Hay varias opciones disponibles para visualizar el complejo anticuerpo-antígeno en inmunohistoquímica:
  • Por Método Directo:
    • Conjugación de una enzima tal como Horseradish Peroxidase (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), que puede catalizar una reacción que produce color.
    • Conjugando un marcador fluorescente.
  • Por Método Indirecto, usando un anticuerpo secundario conjugado ya sea a una enzima o a un marcador fluorescente.

Método de Detección Directo VS. Indirecto

En un inmunoensayo, un marcador permite tanto la detección "directa" o "indirecta" del antígeno. Con la detección directa, el marcador se une a través de un enlace covalente al anticuerpo primario que reacciona directamente con el antígeno en secciones de tejido.

Por otro lado, en el método de detección indirecto, el marcador se une covalentemente a un anticuerpo secundario, que se une al anticuerpo primario durante el inmunoensayo.

El método de detección directo, usando una unión covalente previa del marcador con el anticuerpo primario, sólo requiere una única etapa de incubación con el antígeno y una sola etapa de lavado. El marcador generalmente resulta en la producción de una sustancia colorada o en un aumento en la cantidad de luz emitida a una longitud de onda determinada, si el antígeno está presente. En el caso de ausencia de antígeno no hay unión del anticuerpo primario marcado y por lo tanto no hay señal.
Método directo de marcaje de anticuerposFigura 1 – Método Directo de marcaje de anticuerpo. La bioconjugación se ha realizado con la tecnología nitzipper®.


El método de detección indirecto es un proceso más largo que el directo, ya que se compone de dos etapas de incubación y de lavado en lugar de una sola etapa con la detección directa. El método de detección indirecto comprende:

  • Un primer período de incubación (aproximadamente 1 h) con el anticuerpo primario no marcado (primera capa), durante el cual una pequeña fracción del anticuerpo se une al antígeno diana en el tejido. Por consiguiente, el exceso de anticuerpo primario no unido se elimina mediante un lavado y se añade un anticuerpo secundario marcado (segunda capa).
  • Un segundo período de incubación (de nuevo 1h), durante el cual el exceso de anticuerpo secundario marcado se elimina por lavado y la cantidad de marcador asociado con el anticuerpo primario se cuantifica. En la ausencia de antígeno no hay unión del anticuerpo primario y por consiguiente no hay unión del anticuerpo secundario, y por lo tanto no se obtiene señal.
Método indirecto de marcaje de anticuerposFigura 2 – Método Indirecto de marcaje de anticuerpo. La bioconjugación se ha realizado con la tecnología nitzipper®.


Ambos métodos son válidos y presentan cada uno pros y contras en comparación con el otro. Te proponemos un estudio de los pros y los contras de cada método en la siguiente tabla:

Método DIRECTO Método INDIRECTO
PROS CONTRAS PROS CONTRAS
* Rápido porque sólo se usa un anticuerpo y se necesitan menos etapas.

*Unión específica del anticuerpo secundario (no hay reactividad cruzada).

* Disminución de la variabilidad del ensayo y mejora de la calidad de los datos.

 

* Falta de sensibilidad para detector bajos niveles de expresión del antígeno.

* Necesidad de marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés: consume tiempo y es costoso.

*La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse afectada adversamente por el marcaje.

* No hay flexibilidad en la elección marcador del anticuerpo primario de un experimento a otro.

* Amplificación de señal mínima.

* Altos conocimientos científicos especializados requeridos.

 

* Mayor nivel de sensibilidad y genera una señal más intensa.

* Una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles comercialmente.

*Máxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene, ya que no está etiquetado.

*Mayor amplificación de la señal debido a la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.

 

* Unión no específica del anticuerpo secundario y alto ruido de fondo.

* El uso de un anticuerpo secundario requiere pasos adicionales de bloqueo y de control.

 

Inmunohistoquímica, un proceso todavía limitado por la disponibilidad de productos

Hoy en día, una gran variedad de anticuerpos está disponible comercialmente, pero sólo unos pocos se comercializan directamente con un marcador. Ese es uno de los problemas a los que los científicos se tienen que enfrentar cuando realizan ensayos de inmunohistoquímica.

Como los métodos de detección directos e indirectos son procesos complejos y costosos para los usuarios finales para marcar un anticuerpo, algunos kits de marcaje han sido desarrollados por varias empresas. Sin embargo, esta solución todavía tiene algunas limitaciones, ya que sólo ofrecen la posibilidad de marcar un número limitado de anticuerpos con un número limitado de marcadores y por tanto, no siempre se ajustan a las necesidades de los usuarios finales para la detección de una diana específica, o requieren el uso de equipos de detección, que por consiguiente les convierte en una solución cara.

Por lo tanto, los científicos todavía están limitados en sus avances en este ámbito de investigación, ya que no tienen una solución eficaz, universal y económica que les permita realizar sus inmunoensayos con cualquier tipo de anticuerpos y cualquier tipo de marcador, superando las dificultades de marcaje convencional como la pérdida de anticuerpos, la orientación, etc.


nitzipper® - La tecnología de marcaje de anticuerpos más rápida, simple y versátil 


nitzipper® es una tecnología de bioconjugación innovadora que permite el marcaje directo de anticuerpos, proteínas, péptidos u otras biomoléculas para su uso en diversas aplicaciones, el desarrollo de kits de diagnóstico, descubrimiento de nuevos medicamentos y cualquier otra aplicación que puedas imaginar.

Descubre rápidamente cómo funciona la tecnología de bioconjugation nitzipper® gracias a la imagen de abajo. Fig.3.

Protocolo de bioconjugación nitzipper

Figura 3 - Gráfica con tiempos del protocolo de bioconjugación nitzipper® para el marcaje de anticuerpos.

En este ejemplo, el anticuerpo purificado está funcionalizado con el Linker U de nitzipper® y el marcador está funcionalizado con el Linker T, (linkers complementarios). El protocolo de un solo paso es tan rápido y fácil de usar, que permite marcar los anticuerpos en menos de 30 segundos. El investigador simplemente pipetea los anticuerpos funcionalizados con el Linker U con el marcador de interés funcionalizados con el linker complementario Linker T y se incuba unos 15 minutos.

Obtienes finalmente tu anticuerpo marcado listo para usar en tus ensayos de Inmunohistoquímica en menos de 17 minutos y con una alta pureza (hasta ~ 100% de conjugado anticuerpo-marcador sin necesidad de purificación adicional).

En el siguiente video podrá ver una demostración del proceso de marcaje de un anticuerpo con la tecnología nitzipper®:


nitzipper® ofrece una variedad de anticuerpos, enzimas y más de 30 marcadores fluorescentes que cubren el espectro desde UV hasta el infrarrojo cercano y por lo tanto, será de gran interés para las comunidades científicas que emplean técnicas como ELISA, Citometría de flujo y otras. Esta tecnología única permite al usuario final desarrollar un panel de anticuerpos marcados para todas sus aplicaciones.

Gracias a su simplicidad, versatilidad y eficiencia, nitzipper® ha superado los problemas generalmente asociados a los métodos tradicionales de marcaje anticuerpos, es decir, limitación en los anticuerpos marcados disponibles, la pérdida de material, la orientación de los anticuerpos, etc (ver detalles en la siguiente tabla).

 

Tecnología nitzipper®

Alta relación señal:ruido - la alta señal y el bajo ruido de fondo permite aumentar la sensibilidad y / o reducir la cantidad de conjugado necesaria por ensayo.
Alta amplificación de la señal debida a la unión de varios marcadores al anticuerpo y a un ruido de fondo bajo.
Alta pureza - hasta ~ 100% de anticuerpos conjugados con marcadores. Sin necesidad de etapa de purificación adicional.
La inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene gracias al protocolo bioconjugación nitzipper que conserva sus propiedades.
Gran flexibilidad en la elección del anticuerpo primario y del marcador de un experimento a otro, ya que nitzipper® es una herramienta versátil y que puedes marcar directamente el anticuerpo de interés por ti mismo.
Con un solo paso, mezclando el anticuerpo y el marcador, no es necesario ser un experto o utilizar cualquier equipo adicional para realizar el marcaje de anticuerpos.

 

Descubre nuestra gama completa de productos para Inmunohistoquímica: 


Diferentes tipos de marcadores usados en Inmunohistoquímica

Con el fin de visualizar la reacción inmunológica antígeno-anticuerpo bajo el microscopio, el anticuerpo se puede marcar con una enzima, fluoróforo, etc. Los anticuerpos marcados con enzimas se pueden visualizar bajo el microscopio por medio de métodos histoquímicos enzimáticos mediante reacciones cromogénicas. Los anticuerpos marcados con marcadores fluorescentes se pueden visualizar directamente mediante un microscopio de fluorescencia.


  • Enzimas

Las enzimas son proteínas que actúan selectivamente sobre sus sustratos, acelerando una reacción que convierte los sustratos en diferentes moléculas llamadas productos.

Como se ha dicho anteriormente, los anticuerpos marcados con enzimas pueden ser visualizados por medio de métodos histoquímicos enzimáticos cromogénicos, mediante reacciones en las que un sustrato incoloro soluble se convierte en un compuesto coloreado insoluble en agua, ya sea directamente o en una reacción acoplada. La enzima la más utilizada es el HRP.

Descubre nuestros Anticuerpos para Western Blot


  • Marcadores Fluorescentes

La microscopía de fluorescencia se basa en el fenómeno en el que la absorción de la luz por los marcadores fluorescentes (también llamado fluoróforos o fluorocromos) es seguida por la emisión de luz a longitudes de onda más largas, por lo general en la región visible del espectro. Pueden ser visualizados en microscopía de fluorescencia usando filtros especiales. Descubre la amplia gama de colorantes fluorescentes compatibles con la tecnología nitzipper® en la tabla de abajo.

Descubre nuestros marcadores fluorescentes nitzipper®. 

Tabla 1 - Marcadores fluorescentes nitzipper® (ordenados por longitud de onda de emisión creciente).

Color de emisión

Marcador

Absorpción max. (nm)

Emisión max. (nm)

Coeficiente emisiones

(M-1.cm-1)

Alternativa a

nitzipper ref.

UV-Visible

DY-490

491

515

73,000

Cy2

#210001

FITC

494

520

78,000

#210020

DY-495

494

521

70,000

FITC, Alexa Flour® 488, ATTO 488

#210002

DY-530

533

554

100,000

Alexa Fluor® 532, ATTO 532

#210003

DY-548

558

572

150,000

#210005

DY-547

558

573

150,000

Cy3B, Alexa Fluor® 546, Atto 550

#210004

DY-555

547

573

100,000

TAMRA

#210007

DY-556

548

574

100,000

Cy3

#210008

DY-550

562

577

120,000

#210006

DY-590

581

600

120,000

Texas Red®, Alexa Fluor® 568, Cy3.5

#210009

DY-615

623

643

200,000

ATTO 620

#210010

DY-631

637

657

200,000

ATTO 635, ATTO 637

#210011

DY-636

647

670

200,000

ATTO 647

#210012

DY-649

656

670

250,000

IRDye® 650

#210014

DY-647

653

673

250,000

Cy5 and Alex Fluor™ 647, APC

#210013

DY-651

655

677

220,000

#210015

DY-679

679

698

200,000

Alexa Fluor® 680, IRDye® 680

#210017

DY-676

675

699

180,000

Cy5.5, ATTO® 680

#210016

DY-681

692

709

140,000

#210018

DY-682

692

709

140,000

#210019

Near-IR

DY-700

707

728

140,000

Alexa Fluor® 700

#220001

DY-701

709

730

140,000

#220002

DY-751

752

772

270,000

Cy7, Alexa Fluor® 750

#220

DY-782

785

794

170,000

IRDye® 800CW

#220005

DY-781

784

796

170,000

#220004

Mega-Stokes

DY-485-XL

488

559

50,000

#230003

DY-510-XL

509

590

50,000

#230005

DY-480-XL

504

631

50,000

#230002

DY-520-XL

522

662

50,000

#230006

DY-521-XL

526

666

50,000

#230007

 

 


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